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381506
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PowerPoint
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yangyiner
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2019-10-31
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生物課件PPT
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藥品微生物限度檢測ppt

藥品微生物限度檢測ppt免費下載是由PPT寶藏(浙江体彩6十1玩法说明 www.oowhs.com)會員yangyiner上傳推薦的生物課件PPT, 更新時間為2019-10-31,素材編號381506。

這是藥品微生物限度檢測ppt,包括了微生物限度檢查的意義,設備,供試品抽樣、保存及檢驗量,實驗,控制菌,沙門菌,銅綠假單胞菌,金黃色葡萄球菌,活螨等內容,歡迎點擊下載。

微生物限度檢查法
目錄
一、簡述
二、設備
三、供試品抽樣、保存及檢驗量
四、實驗
五、控制菌
一、簡述   微生物限度檢查的意義
細菌、霉菌、酵母菌計數是檢測規定企業單位內的非滅菌制劑污染的活菌數量,是判定藥品受到微生物污染程度的重要指標,也是對生產企業的藥品、原料、輔料、設備器具、工藝流程、生產環境和操作者的衛生狀況進行衛生學評價的綜合依據之一。
細菌、霉菌、酵母菌計數均采用平板菌落計數法,這是活菌計數方法之一,也是目前國際上許多國家常用的一種方法。
該方法以在瓊脂平板上,每個細菌(營養瓊脂)、霉菌(玫瑰紅鈉瓊脂)、酵母菌(玫瑰紅鈉瓊脂或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂)形成一個獨立可見的菌落為計數依據。
測定結果只反映在規定條件下所生長的細菌(一群在營養瓊脂上發育的嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落數。不包括對營養、氧氣、溫度、PH和其他因素有特殊要求的細菌、霉菌和酵母菌。
一個細菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一個或多個菌細胞形成。因此供試品中所測的菌落數實際為菌落形成單位數(colony forming unit ,CFU),而不應理解為細菌、霉菌、酵母菌的個數。
二、設備
1 無菌室
1.1結構和要求  無菌室應采光良好、避免潮濕、遠離廁所及污染區(面積不超過10m2,高度不超過2.4m)由緩沖間(2個)、操作間組成。
無菌室內應六面光滑平整,能耐受清洗消毒。墻與地面及墻壁、天花板連接處應呈凹弧形無縫隙,不留死角。操作間內不應安裝下水道。
操作間與緩沖間之間應有樣品傳遞箱,出入操作間和緩沖間的門不應直對。
無菌室內的照明燈應嵌裝在天花板內,室內光照應分布均勻,光照度不低于300勒克斯?;撼寮浜筒僮骷渚ι柚米賢庀呱本疲ǎ病?5W/m3),紫外殺菌燈應距實驗臺面高度不超過1M,并應定期檢查輻射強度,不得低于70μW/cm2(1M距離)。不符合要求的紫外殺菌燈應及時更換。
1.2溫度、濕度 
無菌室內溫度和相對濕度直接影響紫外殺菌燈殺菌效果,故溫度應控制在18~26℃,相對濕度40~60%。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應保持對環境形成正壓、不低于4.9Pa。
1.3操作間
操作間應安裝空氣除菌過濾層流裝置。潔凈度不應低于是C級,局部凈化度為A級,或放置同等級凈化工作臺,并準備藥物天平,乙醇燈,火柴,乙醇棉等。
1.4緩沖間 緩沖間內應有洗手盆,無菌衣、帽、口罩、拖鞋等?;撼寮淠誆揮Ψ胖門嘌浜推淥游?。
1.5潔凈 級 別 及 檢 查方法 通常采用塵粒 數 及 浮 游 菌 數 或 沉 降 菌 數測 定 法。
潔凈室(區)空氣潔凈度級別表
例如:沉降菌
無菌室操作臺消毒擦拭處理后,先啟動層流凈化裝置30min,將備妥的營養瓊脂平板3個(經30~35℃預培養48h,證明無菌落生長。)以無菌方式(或經傳遞箱)移入操作間,置凈化臺左、中、右各1個,開蓋,暴露30min后將蓋蓋上。
在30~35℃培養箱內倒置培養48h,取出檢查。 3個平板生長的平均菌落數不超過1個。
無菌室操作臺或凈化工作臺要定期檢測其潔凈度,應達到A級。凈化工作臺中的高效及中效過濾器應根據檢測情況,必要時予以更換處理。
1.6消毒處理 無菌室應在每次操作前、后均用消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角??懔骶換爸?,同時用紫外殺菌燈照射30min。
2. 2其他設備
凈化工作臺、電熱恒溫水浴箱、培養箱、電熱恒溫干燥箱,微波爐(或其他適宜加熱裝置)、電冰箱、空調、高壓蒸汽滅菌器(使用時要進行滅菌效果檢查并應定期請有關部門檢定)、薄膜過濾裝置、電動勻漿儀等。
2、儀器及器皿
2.1菌落計數器、顯微鏡、電子天平或藥物天平,pH計等
2.2 玻璃器皿
錐形瓶、燒杯、研缽、培養皿、量筒、試管及塞、移液管等
玻璃器皿用前應洗滌干凈,無殘留抗菌物質吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花,置吸管桶內或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應加棉塞或硅膠塞,再用牛皮紙包扎。玻璃器皿,均于160℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽121℃滅菌30min,烘干備用。
3   用具
3.1 大、小橡皮乳頭(放于干凈帶蓋的容器中,并應定期用70%~75%乙醇溶液浸泡)。
3.2 無菌衣、帽、口罩、手套(洗凈后配套,用牛皮紙包嚴)滅菌,備用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。
3.3 接種環 (白銥金或鎳鉻合金, 環徑4~5mm、長度6~10cm)、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、洗手盆、實驗記錄紙等。
4  試液
4.1消毒液
4.1.1  0.1%新潔爾滅、0.2%過氧乙酸、75%乙醇溶液(供洗手、擦拭操作臺面用)。
4.1.2  3%的來蘇爾溶液、5%石碳酸溶液 (配好后裝入玻璃消毒缸內, 供消毒帶菌吸管用;當菌液污染臺面或地面時,將其傾覆其上)
4.1.3    75%乙醇溶液
4.1.4   乳酸、15%過氧乙酸(交替用于對潔凈室熏蒸消毒)
4.2 稀釋劑和試劑
4.2.1    0.9%無菌氯化鈉溶液  
4.2.2  無菌聚山梨酯-80(對含油性供試品具有助溶作用)
4.2.4   pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液
4.2.5   pH6.8磷酸鹽緩沖液
4.2.6   pH7.6磷酸鹽緩沖液等
5  培養基
5.1 營養瓊脂培養基
5.2 玫瑰紅鈉瓊脂培養基
5.3 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基
5.4 膽鹽乳糖培養基
5.4 MUG培養基
培養基制備應注意:
  (1)采用干燥培養基,按說明配制,應對滅菌后的培養基pH值進行校驗。若為自配培養基,原料應挑選,瓊脂凝固力應測定,以確定配制時瓊脂用量。試劑規格應為化學純以上的試劑。
(2)配制的培養基不應有沉淀,如有沉淀,應于溶化后趁熱過濾,滅菌后使用。
(3)培養基的分裝量不得超過容器的2/3,以免滅菌時溢出。包裝時,塞子必須塞緊,以免松動或脫落造成染菌。
(4)培養基配置后應在2h內滅菌,避免細菌繁殖,滅菌溫度為121℃,時間為15min。。
(5)滅菌后的培養基應保存2~25℃、避光的環境,放置時間不能過長,三周內使用,以免水分散失及染菌。已熔化的培養基應一次用完,開啟后不宜再用,固體培養基滅菌后只允許在融化一次。
(6)勿用電爐直接熔化瓊脂培養基,以免營養成份過度受熱而破壞,應用水浴或微波爐加熱,融化的培養基應置于45~50 ℃ 的水浴中,不得超過8h。
(7)過期、檢驗剩余的或檢驗使用后未長菌的培養基應經煮沸后銷毀;已長菌的培養基應在121 ℃滅菌30min后銷毀。
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三、供試品抽樣、保存及檢驗量
1 抽樣
1.1  一般采用隨機抽樣方法,抽樣量應為檢驗用量(2個以上最小包裝單位)的3倍量(以備復試)。
1.2 抽樣時,凡發現有異?;蚩梢傻難?,應選取有疑問的樣品,但機械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。
1.3 凡能從藥品、瓶口(外蓋內側及瓶口周圍)外觀看出長螨、發霉、蟲蛀及變質的藥品,可直接判為不合格,無需再抽樣檢驗。
2  保存
2.1 供試品在檢驗之前,應保存在陰涼干燥處,勿冷藏或冷凍,以防供試品內污染菌因保存條件不妥引起致死、損傷或繁殖。
2.2 供試品在檢驗之前,應保持原包裝狀態,嚴禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。
3檢驗量
即一次試驗所用的供試品量(g、ml 或c㎡)。
除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g 或10ml;膜劑為100c㎡;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加20g 或20ml(其中10g或者10ml 用于陽性對照試驗)。
  
檢驗時,應從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品,大蜜丸還不得少于4丸,膜劑還不得少于4 片。
一般應隨機抽取不少于檢驗用量(兩個以上最小包裝單位)的3 倍量供試品。
四、實驗
1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管(1ml、10ml)、量筒、稀釋劑等移至無菌室內。每次試驗所用物品必須事先計劃,準備足夠用量,避免操作中出入操作間。編號后將全部外包裝(牛皮紙)去掉。
2 開啟無菌室紫外殺菌燈和空氣過濾裝置,并使其工作不低于30min。
3 操作人員用肥皂洗手,關閉紫外殺菌燈,進入緩沖間,換工作鞋。再用消毒液洗手或用乙醇棉擦手,穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。
4 操作前先用乙醇棉球擦手,再用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍,待干后用滅菌的手術鑷或剪刀將供試品啟封。
供試液的制備
供試液的制備根據供試品的理化特性與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1 小時。
除另有規定外,常用的供試液制備方法如下。
1.液體供試品
   取供試品10ml,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,混勻,作為1∶10 的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。
2.固體、半固體或黏稠性供試品
   取供試品10g,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法,混勻,作為1∶10 的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80,并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。
3.需用特殊供試液制備方法的供試品
(1)非水溶性供試品
        方法1    取供試品5g(或5ml),加至含溶化的(溫度不超過45℃)5g 司盤80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中,用無菌玻棒攪拌成團后,慢慢加入45℃的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1∶20 的供試液。
         方法2    取供試品10g,加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的適宜容器中,必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量,充分振搖,使供試品溶解。然后加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml,振搖5~10 分鐘,萃取,靜置使油水明顯分層,取其水層作為1∶10 的供試液。
(2)膜劑供試品
   取供試品100c㎡,剪碎,加100ml 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(必要時可增加稀釋液),浸泡,振搖,作為1∶10 的供試液。
(3)腸溶及結腸溶制劑供試品
    取供試品10g,加pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑)或pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液(用于結腸溶制劑)至100ml,置45℃水浴中,振搖,使溶解,作為1∶10 的供試液。
(4)氣霧劑、噴霧劑供試品
   取規定量供試品,置冰凍室冷凍約1 小時,取出,迅速消毒供試品開啟部位,用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔,放至室溫,并輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液,加至適量的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(若含非水溶性成分,加適量的無菌聚山梨酯80)中,混勻,取相當于10g或10ml 的供試品,再稀釋成1∶10 的供試液。
(5)貼膏劑供試品
   取規定量供試品,去掉貼膏劑的?;げ?,放置在無菌玻璃或塑料片上,粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布)覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑(如聚山梨酯80 或卵磷脂)的稀釋劑中,用力振蕩至少30 分鐘,制成供試液。貼膏劑也可以其他適宜的方法制備成供試液。
稀釋
吸取1:10供試液1ml置加有pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9ml試管中,作為1:100供試液;吸取1:100級供試液1ml置加有pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9ml試管中,作為1:1000供試液,備用。
不具抑菌活性的供試品
    常規法:取1:10級、1:100級、1:1000級供試液各1ml,注入直徑90mm的無菌平皿中,加入約45℃營養瓊脂培養基混勻,平行制備兩個平板。(霉菌、酵母菌同上)
具抑菌活性的供試品
   當供試品有抑菌活性時,采用下列方法進行處理,以消除供試液的抑菌活性后,再依法檢查。常用的方法如下。
    ①培養基稀釋法      取規定量的供試液,至較大量的培養基中,使單位體積內的供試品含量減少,至不含抑菌作用。測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數時,取同稀釋級的供試液2ml,每1ml 供試液可等量分注多個平皿,傾注瓊脂培養基,混勻,凝固,培養,計數。每1ml 供試液所注的平皿中生長的菌數之和即為1ml的菌落數,計算每1ml 供試液的平均菌落數,按平皿法計數規則報告菌數;控制菌檢查時,可加大增菌培養基的用量。
② 離心沉淀法     取一定量的供試液, 500 轉/min離心3 分鐘,取全部上清液混合,用于細菌檢查。
③薄膜過濾法     取供試液1ml,置于薄膜過慮器中,加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml,混均,抽濾,反復加入(不同供試品加入的量不同)抽干沖洗液后,無菌操作取出濾膜,菌面朝上貼于瓊脂培養基上。
④中和法    凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品,可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。
陰性對照實驗
陰性對照實驗等同于“空白實驗”,即不加供試品,按同法操作所的結果,每種培養基均需做。
實驗方法:取實驗用的稀釋劑1ml,置無菌平皿中,每次實驗每種培養基各做2個平皿,倒入培養基,搖均,培養。
陰性對照平板應不得有菌生長。
五、控制菌  
一、大腸埃希菌
大腸埃希菌,為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外,新近發現有非脫羧埃希菌等四個種。
大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內的棲居菌,隨糞便排出體外。
在藥品中檢出大腸埃希菌,表明該樣品受到人和溫血動物的糞便污染,即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌,可引起嬰幼兒、成人爆發性腹瀉。為保證人體健康,口服藥品必須檢查大腸埃希菌。
用4-甲基傘形酮葡糖苷酸(即MUG)和靛基質試驗檢查大腸埃希菌是一項新技術,其檢驗步驟為:在膽鹽乳糖培養基中增菌培養后,取0.2ml轉種于5mlMUG培養基中培養,于5h、24h在366nm紫外光下觀察,看是否發熒光,若熒光為陽性,不顯熒光為陰性,觀察后加入數滴靛基質,液面為玫紅色為陽性,不顯則為陰性。如果MUG、靛基質試驗同為陽性或陰性即可報告結果,如MUG與靛基質試驗不一致時,則需分離培養、革蘭染色、鏡檢及生化試驗鑒別。
原理:利用目標菌限定酶作用的底物的水解產物,產生顏色或熒光反應作為指示系統來鑒定目標菌。
實驗證明96% 的大腸埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUD),約10% 的沙門氏菌屬一些菌種也含有此酶。
MUG被GUD水解,產生熒光,由于熒光反應的敏感度較顏色反應強行千萬倍,易于觀察,沒有主觀性,因而用MUG鑒定大腸埃希菌已被廣泛應用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測。
單一的MUG鑒別大腸埃希菌其漏檢率達6%,鑒于98%的大腸桿菌靛基質試驗為陽性,故將MUG-靛基質試驗結合,用EMB瓊脂平板分離,輔以IMViC試驗(靛基質試驗(I)、甲基紅試驗(M)、VP(乙酰甲基甲醇生成試驗)、枸櫞酸鹽利用試驗(C)四種試驗 ),在理論上可使大腸桿菌的檢出率達99%。
二、沙門菌
沙門氏菌屬是腸桿菌科的重要致病菌,沙門菌分5個亞屬,包括常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、鼠傷寒,豬霍亂等沙門菌在內,迄今已發現2000多個菌型。
藥品中沙門菌,是以鑒定沙門菌屬為準,即對每g(或ml)藥品中是否檢出沙門菌作出檢驗報告。
由于沙門菌菌型繁多,各菌型的生化及血清學特性雖密切相關,卻不盡相同,采用一種增菌增培養基和兩種分離培養基,不可能是所有沙門菌的最適增菌及分離條件。
此外,由于藥品在生產過程中,常受到加熱、干燥等加工步驟的影響,藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態,故須在增菌培養前先進行預增。步驟為:取10g或10ml在不少于200ml的營養肉湯培養基中增菌培養18~24h,再取1ml培養物,接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養基,培養18~24h,劃線于膽鹽硫乳瓊脂或麥康凱瓊脂培養基上,培養18~24h,觀察菌落形態,判定。
三、銅綠假單胞菌
銅綠假單胞菌,習稱綠膿桿菌,為假單胞菌屬菌種,廣泛分布在土壤,水及空氣,人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在,故可通過環境和生產的各個環節污染藥品。
本菌是常見的化膿性感染菌、在燒傷、燙傷,眼科及其他外科疾患中常引起繼發感染,由于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性,增加了治療的難度、國內外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項目之一。
銅綠假單胞菌在膽鹽乳糖培養基中增菌培養18~24h,劃線于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基平板上,觀察菌落形態,判斷。
革蘭染色鏡檢及生化試驗等步驟進行檢驗。
四、金黃色葡萄球菌
金黃色葡萄球菌為葡萄球菌屬中的一種,廣泛分布于自然界,空氣、土壤、水及物品上,人和動物皮膚及與外界相通的腔道中,也經常有本菌存在。本菌可產生多種毒素及酶,這些毒性物質能引起局部及全身化膿性炎癥,嚴重時可發展成為敗血癥和膿毒血癥,是人類化膿性感染中重要的病原菌。
本菌抵抗力較強,干燥情況下能生存數月,80℃30min的條件下尚能存活,5%石碳酸或0.1%升汞溶液10~15min才會被殺死。
金黃色葡萄球菌檢查在營養肉湯中增菌18~24h,劃線于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板,觀察菌落。
革蘭染色鏡檢和血漿凝固酶試驗等步驟進行。
本法適用于外用藥品及一般滴眼劑、眼膏劑的檢查。
大腸菌群
步驟:取不少于10ml的乳糖膽鹽發酵培養基管3支,每只管分別加入1:10、1:100、1:1000供試品各1ml,另取一支乳糖膽鹽發酵培養基管加入稀釋劑1ml作為陰性對照管,培養18~24h,觀察是否有酸氣產生,無為未檢出大腸菌群,有酸氣則劃線于曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基,培養18~24h,觀察菌落形態,判定。
五、 活螨
螨,屬于節肢動物門,蛛形綱,蜱螨目。種類繁多,分布甚廣。 其生活習性各異,分為自由生活和寄生生活兩種類型。在土壤、池沼、江河和湖海里,動、植物體上,貯藏食品和藥品中,都可能有它們的存在。
藥品可因其原料、生產過程或包裝、運輸、貯存、銷售等條件不良,受到螨的污染。
螨可蛀蝕損壞藥品,使藥品變質失效,并可直接危害人體或傳播疾病。能引起皮炎及消化系統、泌尿系統、呼吸系統等的疾病。因此,藥品特別是中成藥,必須進行活螨檢查。
檢查方法:直接法、漂浮法、分離法
結束! 謝謝!
 

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